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关于恒温核酸扩增(ERA)反应引物探针设计问题合集


先达基因 / 2020-07-31

酶促重组等温扩增(Enzymatic Recombinase Amplification,ERA),由苏州先达基因科技有限公司开发,拥有全球自主知识产权,在低温条件下(25-42℃)可对痕量的靶DNA片段进行特异性的扩增,在最适温度35-40℃时,扩增反应时间仅需15分钟,以此达到核酸快速检测的目的。该技术对硬件设备的要求很低,现已应用于研究诊断、公共卫生、食品安全、水产畜牧等各个领域。

而ERA的扩增引物探针可以说是整个反应的关键所在,那么怎样才能设计好其引物和探针呢?





Q:ERA 引物需要多长?




为了充分利用 ERA 的检测速度和灵敏度,建议使用 29-32 个核苷酸长 度的引物。

通常情况下,PCR 引物可用于 ERA 反应体系,但这类引物的检测速度和灵敏度可能不及较长的引物。



Q:ERA 引物应当相距多远?




一般而言,建议两个 ERA 引物产生的扩增片段不应超过 300bp。ERA扩增片段的大小或许没有下限,不过根据 ERA 引物最小长度,扩增片段的大小最小约 80bp。为了获得最快的检测速度,最终的扩增片段长度应为 100-200bp。



Q:ERA 我需要筛选多少物?




这取决于您对检测灵敏度的要求。举例来说,如果您只需要每个反应检测 1000 个分子或以上,那么大多数引物对都够用了。对于极高灵敏度的检测,最好是进行系统性的引物筛选以找到好的 ERA 引物。最初筛选时,测试的引物条数通常是正反向引物各 7 条。测试的引物越多,找到能够检测单个分子的好引物对的几率就越大。


荧光型ERA产品探针




  1. 探针长度为 46-52 个核甘酸,其中至少 30 个位于 THF 位点的 5’端,另外至少 15 个位于其 3’端。

  2. 荧光团与淬灭团只能标记在胸腺嘧啶(T)上,且荧光团与淬灭团间距在2-5个碱基。

  3. THF为替换位于荧光团与淬灭团之间的某碱基,且dT-荧光团或 dT-淬灭团与 THF 之间的核苷酸数量可以是 0、1 或 2。

  4. 探针的3’端需加上阻断基团




试纸型ERA产品探针




  1. 探针长度为 46-52 个核甘酸,其中至少 30 个位于THF位点的 5’端,另外至少15个位于其 3’端。

  2. THF为替换位于荧光团下游30bp后与阻断基团上游15bp之间的某碱基

  3. 荧光团只能标记在胸腺嘧啶(T)上。

  4. 探针的3’端需加上阻断基团





ERA反应需要用多少引物?



基础反应每次需要420nM引物,有时稍微改动一下引物的用量可以提高其性能。对不同引物浓度进行测试(从200nM 到600nM)将有助于找到最合适的引物浓度。



ERA反应需要用多少探针?




反应一般每次需要120nM探针。不过略微改变探针的浓度有时会促进反应的进行。我们可以在一定浓度范围内(从50nM到150nM),根据自己的具体应用对探针进行优化。




现成的PCR引物能用于ERA



通常情况下,PCR 引物可用于 ERA 反应体系,但这类引物的检测速度和灵敏度可能不及较长的引物。



现成的PCR探针能用于ERA




不能。绝大多数常用的PCR探针并不适合ERA反应。特别是用到了聚合酶5’-3’核酸酶活性的探针系统,这样的酶活性完全不兼容。




引物筛选时应该用什么样的条件?



引物筛选的条件最好尽量模拟实际检测时的条件,例如模板的拷贝数、样本纯度等等。



给定引物的性能还能再提高么?




一般来说,稍微改动一下引物的序列可以提高其性能。任何给定的引物都可以通过以下方法进行优化:以单核苷酸为基础略微改变引物的长度;或者保持引物长度不变,以1bp为基础移动引物的位置。经过了改动的引物,需要重新进行扩增活性的测试。




ERA引物的熔解温度应该是多少?



ERA反应是在常温下进行的,DNA的解链与PCR有很大不同。传统估算的熔点不适用于这个系统。



ERA引物需要特别纯化么?




在进行引物筛选的时候,一般不需要纯化。在其他情况下,引物的质量会造成批次间的差异。如果对一致性要求比较严格,建议最好先纯化引物再进行ERA反应。





使用引物和探针的时候还需要注意些什么?



引物和探针需要同时添加到体系中,一先一后会使片段重组出现偏向性。





我该如何选择探针?




如果使用适用于探针的其中一种试剂盒,需要注意的是,在标靶区域选择探针位置时,有一些序列限制。如果存在不合理的限制,本公司可帮助您设计备选检测方案。











引物筛选时应该用什么样的条件?



引物筛选的条件最好尽量模拟实际检测时的条件,例如模板的拷贝数、样本纯度等等。



我如何配制冻干引物、探针?




通常,用 TE(10mM Tris-Hcl pH8.0 0.1mM EDTA)来制备 100μM 的储存溶液, 并长期储存于-20℃。





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