当前位置: 首页 > 产品应用方案 > 资料下载 > 支原体检测试剂盒使用说明书
4

支原体检测试剂盒使用说明书


先达基因 / 2021-01-08

支原体检测试剂盒使用说明书

(产品货号:KMP101)
 
试剂盒标配材料 
组分
货号
24T
96T
溶解剂   DA (白盖)      
DA101
540μl
1.2mL*2
激活剂   MC (绿盖)
MC101
60μl
250μl
支原体阳性质控  (红盖)
KMP101C
50μl
100μl
支原体荧光检测试剂(铝箔袋)
KMP101
24T*1
24T*4
使用说明书
KMP101
1份
1份

检测下限

    本试剂盒最低检测下限为50copies/测试

 

检测下限

   存储在-20℃、干燥、避光的环境,有效期1年。

 

详细实验方案(反应体系为 50μl

1. 按照以下所述制备每份样本的预混液:
组分
每管加样量/μl
溶解剂[1]
20
模板DNA+ddH2O
28
体积
48
充分振荡混匀并短暂离心。
2. 对于每份样本,将48μl预混液转移至每管检测扩增试剂[2]中。振荡混匀[3]直到扩增试剂重悬,并短暂离心。
3. 对于每份样本,在反应管盖上加上2μl激活剂[4],小心盖紧管盖,通过短暂离心使激活剂进入预混液中。短暂振荡混匀[5]并再次快速离心。
4. 将反应管放入恒温仪(40℃)中,启动检测,持续20分钟,每30秒采集一次FAM通道荧光值。
5. 反应结束后,保存数据并弃置样本管。
操作注意要点:
[1] 溶解剂需完全融化混匀,否则会对实验产生影响。
[2] 荧光扩增试剂在使用前放置室温平衡10min,剩余未用尽的试剂应注意防潮密封保存
[3] 此处振荡混匀旨在将扩增试剂重悬,使体系分散均匀,混匀时间应在3-5s,3000rpm
[4] ERA反应是靠激活剂来启动,一旦加入激活剂,务必立即上机孵育
[5] 此处振荡混匀时间应在3s左右,时间过长会导致检出时间延后。
 
 

阳性对照反应

支原体检测试剂盒包括支原体阳性质控(浓度:105cp/μl),可用于检测试剂盒各组分的活性。检测方法与上述实验方案相同,反应温度推荐使用40。支原体荧光检测试剂中含探针,并带有荧光素(FAM)标记物,最佳激发波长为492nm,最大发射波长为520nm。
注:如使用ABI系列PCR仪,请务必于passive reference和quencher处均选择“none”。
 
组分
每管加样量/μl
溶解剂
20
ddH2O
26
支原体阳性质控
2
激活剂
2
体积
50
 

*支原体阳性质控、阴性对照实时荧光曲线如上右图,所用仪器为先达单波长恒温荧光检测仪GS8

 

注意事项

1. 本试剂盒仅用于非医用检测;应存储于-20℃、干燥、避光的环境。
2. ERA扩增产物的气溶胶易造成假阳性,为避免交叉污染,试剂配制区与扩增分析区应分隔开。
3. 实验时应设置不加模板的空白对照,以确认是否有待扩增核酸的污染。
4. 在不同的核酸提取方法下,所提取的样本DNA含量和纯度会有差异,可能会导致出现扩增效率不一的现象(详情请查阅PCR抑制剂:乙醇、苯酚、血红素等等)。
5. 支原体阳性质控建议添加2μl~5μl,待检样本添加量范围为2μl~10μl。如果待检样本浓度较高,则仅需添加2μl,反之,则加大样本添加量,最大体积不超过10μl。
6. 如果模板DNA拷贝数低,请在反应4分钟后取出反应管,振荡混匀并短暂离心,再放回恒温仪中。
7. 任何能激发和检测所选荧光团,并能将温度稳定于40℃的荧光检测仪都适用于荧光探针检测(GS8恒温荧光检测仪,ABI 7500,LightCycler480,CFX 96等荧光定量PCR仪)。
8. 扫码关注公众号,输入“问题解答”获取操作视频及常见问题解决方案。