ERA（酶促重组等温扩增）技术常见问题解答
先达基因 / 2020-04-29
ERA技术
通过模拟生物体遗传物质自身扩增复制的原理，将来源于细菌，病毒和噬菌体的特定重组酶、外切酶、聚合酶等多酶体系进行改造突变并筛选其功能，通过不同的核酸扩增反应体系进行优化组合，从而获得核心的重组等温扩增体系，在37-42℃恒温条件下，可将微量DNA/RNA的特异性区段在数分钟内扩增数十亿倍，即（酶促重组等温扩增，Enzymatic Recombinase Amplification）ERA技术方法。
—— 常见问题分类 ——
一、ERA技术的基础知识
二、关于引物、探针的设计和使用
三、关于实验操作的细节
四、下游检测方案的选择
五、结果的分析
一、ERA技术的基础知识
（一）原理方面
1. 试剂盒的原理是什么？
（二）与其他方法比较
1. ERA检测试剂盒的扩增产物是否可以用于SHERLOCK或DETECTR实验？
2. ERA与RPA、LAMP有什么区别？
（三）特点（温度、速度、灵敏度、特异性、稳定性）
1. ERA扩增试剂盒应在怎样的温度下使用？
2. 当向扩增试剂中加入事先配制好的预混液时，扩增试剂变浑浊，是否正常？
3. 提高反应温度，反应速度会不会加快？
4. ERA扩增反应的产物可以保存吗？
5. 收到试剂盒发现泡沫箱中冰袋融化，箱内温度接近室温，试剂盒还能使用吗？
6. 可以对ERA扩增产物进行终点分析吗？
7. 实验出现假阳性的结果，可能的原因有哪些？
（一）原理方面
1. 试剂盒的原理是什么？
先达基因试剂盒的原理为酶促恒温扩增反应，利用引物在重组酶的作用下与目标序列结合，然后在等温聚合酶的作用下延伸和扩增，具体可以点击此处参考。
（二）与其他方法比较
1.ERA检测试剂盒的扩增产物是否可以用于SHERLOCK或DETECTR实验？
ERA检测试剂盒的扩增产物可以用于SHERLOCK或DETECTR实验方法进行检测。根据经验，SHERLOCK或DETECTR方法对盐离子浓度比较敏感。为了避免ERA扩增体系对后两者检测体系中的盐离子浓度带俩干扰，在使用过程中需要对检测反应体系中盐离子浓度进行适当优化。
2.ERA与RPA、LAMP有什么区别？
ERA技术由苏州先达基因研发团队研发，具有全球自主知识产权。它利用抗体制药领域先进的Molecular Design、Directed Evolution、Affinity Maturation等技术手段，将来源于细菌，病毒和噬菌体的特定工具酶进行改造突变并筛选其功能，通过组合优化获得一种全新的核酸恒温快速扩增反应体系。在恒定温度条件下，仅需7-10分钟即可完成对靶DNA片段进行数亿倍的特异性扩增，其低温适应性和灵敏度等方面相比同类技术产品有了新的突破，达到全球行业领先水平，目前该技术方法申请了国家专利（申请号:201910262085.3，202010160768.0，202010394538.0，202210666871.1）和国际专利(申请号:PCT/CN2019/090586，PCT/CN2021/082213）。
ERA与RPA技术皆源于上世纪70、80年代，YASUO IMAE、Sinha、Formosa 等科学家们的科研成果，他们发现并利用重组酶、DNA聚合酶以及单链结合蛋白，成功进行了体外核酸扩增。ERA技术从原理上与RPA技术非常类似，所不同的是使用的酶来源于不同的物种，并进行了工程化改造，会让反应变得更快。
LAMP技术的扩增原理是基于DNA在65℃左右，利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，在链置换型DNA聚合酶的作用下，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA扩增。
与LAMP技术相比而言，ERA技术在以下方面有比较明显的优势：
1）需要的引物数量少，设计更简单。
2）扩增产物可直接用于克隆测序，方便判断。
3）平衡兼顾了灵敏度和特异性，极大地降低了假阳性的产生。
（三）特点（温度、速度、灵敏度、特异性、稳定性）
1.ERA扩增试剂盒应在怎样的温度下使用？
标准的ERA扩增试剂盒的反应体系可在37℃-42℃的温度范围内进行高效扩增。低于37℃，不利于混合酶体系发挥最佳扩增效率；超过42℃，酶会加速失去活性，从而对反应体系产生不利影响，可能无法达到扩增程序的检出水平。
目前升级后的ERA科研产品（包括ERA、RT-ERA扩增试剂盒）默认推荐反应温度为40℃。关于反应条件优化，对于DNA为模板的扩增反应，反应温度可设置为37~40℃；对于RNA为模板的扩增反应，反应温度可设置为40~42℃。
2.当向扩增试剂中加入事先配制好的预混液时，扩增试剂变浑浊，是否正常？
扩增体系配制瞬间的浊化现象，是ERA试剂反应体系的正常现象。这是由于参与反应的酶类型多、浓度高，ERA反应体系在形成时常常会出现肉眼可见的乳状液。
3.提高反应温度，反应速度会不会加快？
取决于引物探针和多个酶的动力学参数。温度太高有时会失去相互作用导致效率下降，甚至导致反应体系中部分酶活力下降，使探针失去保护导致假阳性发生。一般43℃以上效率就差很多。
4. ERA扩增反应的产物可以保存吗？
基础型扩增试剂盒的扩增产物均可以在4℃环境下短期保存。如需长期保存，建议置于-20℃。
荧光型扩增试剂盒的结果一般由仪器实时记录，保存过程中核酸酶等会消化扩增产物，导致再次检测的结果不准；如保存后用其他检测手段，会增加气溶胶污染风险。试纸型扩增试剂盒的扩增产物也不建议保存，可能会带来假阳性风险。
5. 收到试剂盒发现泡沫箱中冰袋融化，箱内温度接近室温，试剂盒还能使用吗？
可以，我们的产品37℃稳定性测试可以达到7天，活力无明显降低。所以，室温下3 天以内放心使用。对于长期储存，我们建议储存在-20℃。
开封后未用完的试剂，最好不要在4℃储存时间过久（一般不超过3天），因为4℃水分子还是有一部分以气态运动，会使冻干试剂吸潮，导致其中酶活力下降。最佳储存环境为密封、干燥、-20℃环境下。
6. 可以对ERA扩增产物进行终点分析吗？
可以，但不包括荧光型试剂盒。因为在反应结束后，未经迅速失活处理，核酸酶会逐渐消化扩增产物。要分析扩增产物，请使用基础型（RT）或试纸型试剂盒进行跑胶检测分析。
7. 实验出现假阳性的结果，可能的原因有哪些？
如果在无模板对照中观察到假阳性结果，可能的原因主要由污染，或引物设计引起。
1）通常由污染引起的假阳性比较多见，现象为无模板对照或阴性对照的检测结果显示与阳性结果非常类似。以荧光检测为例，具有扩增曲线，荧光值较高且一般与阳性值相差不大。对此，我们建议区分试剂配制区和扩增分析区。在使用任何扩增后打开反应管的终点检测方法时，必须采用严格的污染控制措施，且在开盖前务必对反应产物降温以平衡内外气压差，降低气溶胶污染风险。
要排除或清除污染，我们建议用消毒液或75%的酒精对工作区域进行彻底消毒，有条件的对工作区域进行持续通风，并使用新的扩增试剂（溶解剂、激活剂等）。一般重复几次清洁消杀后可彻底清除污染。
2）引物设计问题导致，现象为无模板对照或阴性对照的检测结果显示与阳性结果有较大的差异。以新冠核酸检测试剂盒检测为例，一般假阳性的出峰时间较晚（在13分钟以后），荧光Δ值较低且扩增曲线不明显。针对此类问题，我们建议应重新设计和筛选引物、探针。
二、关于引物、探针的设计和使用
1. 为PCR设计的引物是否适用于ERA？
2. RPA和ERA可以共用引物吗？
3. ERA引物设计的核苷酸数目多少？
4. 延长ERA的引物是否可以提高扩增的性能？
5. 用于ERA扩增的引物需要多长？
6. ERA引物的扩增产物多长比较合适？
7. 一般需要设计多少条引物供筛选？
8. 如何选择探针？
9. 如何对干粉引物、探针进行溶解和长期保存？
10. 如何溶解引物、探针及模板？
11. 经过一种ERA扩增试剂盒（如荧光型）测试良好的引物，能直接用于其他类型的（如基础型或试纸型）ERA扩增试剂盒吗？
12. 同样的引物对和模板浓度重复多次，起峰时间和荧光值的一致性如何？
13. 产品使用中，除了引物探针，还能从哪些方面去优化?
1.为PCR设计的引物是否适用于ERA？
可以用，但不建议，因为ERA引物设计有特定规则，PCR设计的引物可能不是ERA反应的最佳选择。
2.RPA和ERA可以共用引物吗？
技术是通用的，但是因为我们的酶都是优化突变过，适配程度有时需要进行微调。
3.ERA引物设计的核苷酸数目多少？
一般是28-35个核苷酸。
4.延长ERA的引物是否可以提高扩增的性能？
理论上45个核苷酸作为引物可以使用，甚至可以更长，然而容易引起错配且在引物选择上范围更小。
5.用于ERA扩增的引物需要多长？
为了充分利用ERA的检测速度和灵敏度，建议使用28-35个核苷酸长度的引物。通常情况下，更短一些的PCR引物也可用于ERA反应体系，但短引物的特异性和灵敏度及扩增效率可能不及较长的引物。
6.ERA引物的扩增产物多长比较合适？
一般而言，考虑到检测效率，两条ERA引物产生的扩增片段长度不应超过300bp。虽然ERA扩增片段一般不设置下限，不过根据ERA引物的最小长度，扩增片段的最小约70bp。为了获得快速且准确的检测结果，建议最终的扩增片段长度应为100-200bp。
7.一般需要设计多少条引物供筛选？
取决于对检测灵敏度、特异性的要求。举例来说，如果只需要每个反应检测1000个分子或以上，那么大多数引物对都是够用。对于极高灵敏度、特异性的检测，建议进行系统性的引物筛选以获得符合要求的最佳ERA引物。最初筛选时，测试的引物条数通常是正反向引物各7条。测试的引物越多，更快筛选到高灵敏度且高特异性引物对的几率就越大。
8.如何选择探针？
不同的应用场景和试剂盒，选用的探针是不同的，需要注意的是，在标靶区域选择探针位置时，有一些序列限制，具体请见引物探针设计指南。
9.如何对干粉引物、探针进行溶解和长期保存？
通常，用1X TE Buffer（10mM Tris-Hcl pH8.0 0.1mM EDTA）来溶解成100μM的储存溶液，并长期储存于-20℃。
10.如何溶解引物、探针及模板？
对于引物探针，通常用 1X TE Buffer溶解为100μM浓度的储存母液，或 10μM浓度的工作液。不推荐用ddH2O溶解。
如果模板是RNA样本，需在TE中填加适量RNA酶抑制剂来延长保存时间。建议使用当天从高浓度储存母液稀释。
11.经过一种ERA扩增试剂盒（如荧光型）测试良好的引物，能直接用于其他类型的（如基础型或试纸型）ERA扩增试剂盒吗？
不一定，需要详细研究、审慎对待。
如果已通过实验筛选出ERA基础型核酸扩增试剂盒的引物，当替换为ERA荧光型或ERA试纸型核酸扩增试剂盒时还需要引入新的探针或修饰后的引物。而电泳跑胶检测、荧光检测或是测流层析检测对引物的最佳组合可能有着不同的要求。通常情况下，使用相同的引物探针从ERA荧光型转为ERA试纸型能获得相当可靠的结果。荧光检测的最佳引物/探针组合不一定是电泳跑胶检测的最佳引物组合，反之亦然。
从DNA检测分析转为RNA检测的逆转录分析情况更复杂，因为逆转录酶对引物有着不同的偏好。我们建议直接使用RT-ERA扩增试剂盒在RNA模板上设计RNA检测，而不是先使用底物为DNA的ERA扩增试剂盒，优化后尝试转为使用RT-ERA扩增试剂盒。
12.同样的引物对和模板浓度重复多次，起峰时间和荧光值的一致性如何？
会有一些波动，起峰数据差异较小，粗略有大概上百万个数据中在扩增起峰时间在10-15%的差异。
扩增高度可能会在10%-30%之间有差异，1000个拷贝以上的差异在10%以内。以上数据仅供参考。
13.产品使用中，除了引物探针，还能从哪些方面去优化?
除了引物探针用量，在反应温度，溶解剂或激活剂用量等方面都可以优化，如果您有更高的灵敏度要求，可以和我们技术人员联系，我们会为您提供更具体的优化方案。
三、关于实验操作的细节
1. 可以制备预混液吗？
2. 可以将激活剂添加至重悬试剂中吗？
3. 可以在反应体系中加入更多/更少的溶解剂吗？
4. 跑胶之前需要纯化ERA扩增产物吗？
5. 使用RT-ERA扩增试剂时，如何改善RNA靶基因的扩增并提高反应结果的一致性？
6. 在用测流层析试纸进行检测之前需要稀释ERA扩增产物吗？
7. 裂解液裂解菌以后，可以直接不用纯化就扩增吗
8. 基础款试剂盒电泳的时间一般为多少？
9. 基础款试剂盒阳性样本的条带是多少？
10. 试剂盒中提供的阳性对照拷贝数为多少？
11. 荧光款试剂盒，如何缩短检出时间？
12. 支原体试剂盒如何设置仪器的反应时间或循环数？
13. 为什么要去掉热盖？
14. 实验中有时会出现低浓度比高浓度模板的荧光值更高的原因是什么？
15. ERA检测方法的LOD值一般是多少？LOD是如何确定的？
16. ERA技术是否可以进行多重PCR扩增？
17. 为什么激活剂要求单独加在管盖上，而不可以直接预混到反应体系中？
18. 扩增产物电泳时出现非特异性条带，如何进行扩增条件优化？
19. ERA扩增试剂盒对不同样本处理有何要求？
20. 使用ERA或RT-ERA 扩增试剂时，能否将激活剂和样本提前预混？
21. cod UNG 的用量、浓度是多少？
22. RNase抑制剂（RNase Inhibitor）的用量？
23. ERA扩增产物可以用染料法检测吗？
24. 提前混匀时如何避免气溶胶污染呢?
1.可以制备预混液吗？
可以，尤其是当您想同时建立多个反应时。
在检测不同的样本的同一个目标靶点时，可以将溶解剂、引物和探针（如果使用）混合在一起，并加到扩增试剂中重悬。然后将不同的样本加入反应体系，最后加入激活剂启动反应。
在针对同一个样本筛选不同引物时，可以将溶解剂、样本、探针（如果使用）和一条引物制成预混液，并将其分装到1.5ml小管后再分别加入不同的引物。只有当两个引物都存在时，才能重悬扩增试剂并启动扩增反应，否则会使扩增酶复合物的形成偏向先添加的引物，从而影响扩增效率。
2.可以将激活剂添加至重悬试剂中吗？
标准的操作流程中，我们建议将激活剂添加到8联排反应管的盖子上，并将其离心至反应体系中，这样便可确保反应同时开始。
特定情况下为了节约时间和方便起见，若您使用的是基础型或试纸型扩增试剂盒，是可以将激活剂添加至重悬试剂中的。不过，一旦加入激活剂，反应体系将会立即启动，单次处理较多样本时，同一个实验组内的样本容易出现结果偏差。
若您使用的是荧光型扩增试剂盒，是不可以将激活剂添加至重悬试剂中的。当体系里面有激活剂存在时，引物和探针会受到核酸酶的破坏，后续置于荧光检测仪中时便出现更高的荧光基线。
3.可以在反应体系中加入更多/更少的溶解剂吗？
不可以。
加入比建议更多或更少的溶解剂会对ERA反应的进行方式产生不利的影响。溶解剂中包含ERA反应所需的成分，因此加入更多或更少的溶解剂将会改变其在重悬试剂中的最终浓度。
4.跑胶之前需要纯化ERA扩增产物吗？
需要。
ERA扩增反应体系里的酶和蛋白会干扰正常的琼脂糖凝胶电泳，如果不进行产物纯化，蛋白核酸结合物可能堵塞胶孔，导致跑不出条带，或者跑出来的条带可能是弥散的而不是干净的。
5.使用RT-ERA扩增试剂时，如何改善RNA靶基因的扩增并提高反应结果的一致性？
如果模板RNA在添加到反应之前先与激活剂结合，可能会稳定RNA的三级结构，从而抑制逆转录酶。建议先将模板RNA添加到反应混合液中再添加激活剂。针对同时检测多个RNA样本情况，建议将RNA与激活剂分别添加到反应盖子的相对两侧，再通过离心同时混合扩增体系，这样可提高扩增的一致性。
6.在用测流层析试纸进行检测之前需要稀释ERA扩增产物吗？
需要。
ERA反应体系里的试剂和蛋白会干扰测流层析试纸上的抗体，如果不进行充分稀释就会出现非特异性结合和假阳性信号。一般建议根据实际扩增情况，将产物稀释40-60倍左右。
7.裂解液裂解菌以后，可以直接不用纯化就扩增吗？
可以的，建议搭配先达基因的样本释放试剂使用。
8.基础款试剂盒电泳的时间一般为多少？
电泳条件建议设置为120-180V，15-20分钟左右。
9.基础款试剂盒阳性样本的条带是多少？
这个根据引物设计者的设计有所区别，推荐扩增子设计长度在100bp左右。
10.试剂盒中提供的阳性对照拷贝数为多少？
不同检测产品阳性对照的拷贝数有所不同，与具体试剂盒附带的参考品实物为准。更多信息可联系我们的技术支持人员获得。
11.荧光款试剂盒，如何缩短检出时间？
可以考虑以下优化：
1）先试试独立单孔或双孔操作。
2）适当调整一下引物浓度，尤其适量增加。
3）按照引物探针设计指南对引物或探针进行设计方案优化。
4）适当调整一下温度，37-42℃之间。
5）激活剂浓度适量调整。
12.支原体试剂盒如何设置仪器的反应时间或循环数？
1）介于该产品的反应速度，一般情况下20分钟就足够进行结果判定，相对于qpcr 的循环数约为40个循环，一般延长到30分钟也可以的(约60个循环）。
2）75个循环后曲线下降的原因为核酸经过快速扩增后形成大量的焦磷酸镁导致管中产物变混浊导致荧光信号下降。
13.为什么要去掉热盖？
热盖温度冲下去会造成实际反应温度过高，使酶失效。
14.实验中有时会出现低浓度比高浓度模板的荧光值更高的原因是什么？
对于低浓度样本比高浓度样本荧光值高，先达基因ERA试剂与qPCR试剂一致，由于受人为操作、试剂的管间差、设备孔间差等影响，最终的反应荧光终点值可能都存在一定随机性，属于正常现象。同理,qPCR扩增或检测试剂采取Ct值而非荧光终点值作为判断依据。
15.ERA检测方法的LOD值一般是多少？LOD是如何确定的？
LOD值一般是5-50拷贝/测试，在先达基因的仪器上自动判定。按照医疗器械的一般检测标准，如LOD实验做20次，至少保证19次能检测出阳性。
16.ERA技术是否可以进行多重PCR扩增？
可以。目前利用ERA方法进行2重扩增比较稳定。进行多重PCR扩增时，单纯使用ERA技术进行检测，灵敏度会有不同程度的降低。如果结合CRISPR技术进行扩增后检测，则可以做到4重甚至更多。具体方法可参见张峰和 Jennifer 在 Nature 和 Science 上发表的系列文章。
17.为什么激活剂要求单独加在管盖上，而不可以直接预混到反应体系中？
由于该技术体系反应非常迅速，在室温下也能反应，激活剂加入后反应即直接启动，所以将激活剂加在管盖上，然后统一离心混匀，保证反应结果的科学性。由于激活剂为镁离子盐溶液，非常容易混匀的，离心后在反复颠倒混匀3~5次即可混匀。
18.扩增产物电泳时出现非特异性条带，如何进行扩增条件优化？
首先检查所使用的引物的特异性是否有问题的，请结合模板序列和样本类型充分分析。如果引物没有明显的错配，则可以主要从以下几个方面进行实验条件优化：
① 缩短扩增时间：时长从12-20分钟，每3分钟作一个梯度。
② 下调引物量：适当下调使用量，每10%作一个梯度。
③ 提高反应温度：温度适当提高到38-42℃之间。
④ 减少激活剂：以 10%-20%作一个梯度。
19.ERA扩增试剂盒对不同样本处理有何要求？
1）拭子、菌体、组织等样品经过简单核酸释放即可用于ERA扩增实验。
2）血液、粪便、呕吐物等样本存在大量抑制物（如血红素、腐殖质、蛋白酶、植物多糖等）需经过核酸提取处理。
3）核酸提取过程需避免如乙醇、异丙醇、酚、氯仿等对反应有抑制作用的有机溶剂残留。
4）为获得最佳检测效果，建议提取。
20.使用ERA或RT-ERA 扩增试剂时，能否将激活剂和样本提前预混？
不同样本类型，具体对待。
DNA类模板可以提前预混。
RNA类模板不可以提前预混，因为激活剂和RNA会形成聚合物，影响扩增。
21.cod UNG 的用量、浓度是多少？
cod UNG 的初始浓度为 1U/µl，50µl 反应体系中加 0.5-2µl，因此工作浓度为 0.01-0.04 U/µl。
22.RNase抑制剂（RNase Inhibitor）的用量？
RNase抑制剂浓度为40U/µl，工作浓度为5U/µl，50µl反应体系中加0.2-0.5µl。
23.ERA扩增产物可以用染料法检测吗？
理论上可以，但不建议采用，因为对引物探针设计以及反应体系设置有很高的要求，否则非常容易出现假阳性。
24.提前混匀时如何避免气溶胶污染呢?
没有添加激活剂的情况下，是不会产生扩增反应的，所以不用担心污染问题，在扩增过程和结束后，一定要保证试剂管的密封，防污染的方法也和PCR的方法相同的。
四、下游检测方案的选择
1. 如果要运行ERA反应，需要哪种类型的仪器设备？
2. 先达基因的GS8恒温荧光检测仪能导出最终荧光值吗？
3. 先达基因的恒温扩增仪有医疗器械资质吗?
4. 支原体检测试剂盒是否可以用qPCR仪器进行检测？
1.如果要运行ERA反应，需要哪种类型的仪器设备？
基础型和试纸型适用于任何能保持37-42℃的稳定温度的设备。
针对荧光型ERA核酸扩增试剂盒，推荐使用先达基因专门配套开发的2类恒温荧光检测仪：GS8和基因镜®。
GS8恒温荧光检测仪可同时检测8个样本，实现恒温扩增与荧光信号检测于一体，简单便携。在恒定温度条件下，可对样本核酸的特定区域进行扩增及定性检测，通过实时荧光扩增曲线，在20分钟内即可完成检测。GS8适合食品安全、环境卫生、农林水产畜牧等各种作业场景中等通量的检测需求。
基因镜®微型恒温荧光检测仪配置了特殊的光学系统，灵敏度更高、操作更简便，单次检测1个样本。仪器本身自重仅200g，可连接充电宝工作，非常适合在包括家庭、口岸、户外等场景下开展快速现场核酸检测工作。
除了以上2款专用设备外，使用荧光型试剂盒进行实时反应时，可使用能激发并检测所用荧光基团并能保持37-42℃稳定温度的仪器设备或实时热循环仪，如ABI 7500，LightCycler480，CFX 96等荧光定量PCR仪。注意，在运行ERA反应时，热盖功能应关闭，以免加速酶失活影响扩增。
2.先达基因的GS8恒温荧光检测仪能导出最终荧光值吗？
可以导出，单位是相对荧光值。
3.先达基因的恒温扩增仪有医疗器械资质吗?
目前基因镜®系列恒温荧光检测仪均已取得欧盟医疗器械CE认证，国内的医疗器械认证正在申报中，取得医疗器械证书后公司将统一发布通告。
GS8恒温荧光检测仪专门针对科研场景研发。
4.支原体检测试剂盒是否可以用qPCR仪器进行检测？
可以，在反应设置是选择FAM荧光通道，30秒/循环并采集荧光，40~60个循环。
五、结果的分析
1. 在荧光型检测试剂盒的反应即将结束时，有时会看到荧光信号值急剧升高，正常吗？
2. 荧光试剂盒斜线爬升而不是S线爬升？ 为什么荧光值不高斜率低？
3. 如何使用一般荧光定量PCR仪进行读数分析？
4. 控制反应时间和上机时间，对结果的影响如何？不同批次检测之间的读数一致性如何？
5. 为什么扩增反应会出现假阳性?
6. 先达基因核酸释放剂产品设置的内参，除鼻咽拭子，其他体液样本适用吗?
7. 假如实验操作没有问题，但结果的重现性依然很差，问题主要出现在恒温扩增的哪方面?
8. 为什么扩增结果信号不稳定?
1.在荧光型检测试剂盒的反应即将结束时，有时会看到荧光信号值急剧升高，正常吗？
正常。
在荧光型扩增反应中，聚合酶和核酸酶处于动态的竞争关系。前期聚合酶反应占优势，而随着反应的能量逐渐耗尽，后期核酸酶的底物增多，结果导致探针更快地裂解，因而出现荧光信号值剧增的现象。
2.荧光试剂盒斜线爬升而不是S线爬升？ 为什么荧光值不高斜率低？
扩增效率比较高，反应未到平台期，阳性量非常高是正常的；
这与混匀有一定关系，试剂再混匀充分一些，峰形斜率会增高。另外，用涡旋仪混匀时不要长时间按着，建议按3秒松一下，3-4次，这样小体积管子更容易混匀。第一步在200µlPCR管进行混匀效果更充分。
3.如何使用一般荧光定量PCR仪进行读数分析？
一般有荧光定量PCR仪就可以使用，在仪器设置方面选择“FAM”通道，参照信号选择“无”，每30秒收集一次信号；在反应设置方面要求第一步预变性温度设为37℃，时间30秒，第二步循环反应设置为一个循环30秒，40个循环。读数是根据反应荧光扩增曲线，在反应时间（循环）内产生扩增曲线为阳性，峰值越高表明模板拷贝数越高，如未产生曲线的，判为阴性。另外，先达基因研发和生产一款更加便捷式的恒温荧光检测仪，体积小、使用方便，价格较低、结果自动判读。
4.控制反应时间和上机时间，对结果的影响如何？不同批次检测之间的读数一致性如何？
由于ERA技术体系反应非常迅速，在室温下也能反应，激活剂加入后反应即启动，所以上机时间要求控制在1分钟以内；同时反应时间一般规定在20分钟，最长不超过30分钟。一般操作熟练后，不同批次检测的结果一致性较好。
5.为什么扩增反应会出现假阳性?
导致假阳性的最主要两种可能：
1）气溶胶污染：这方面问题ERA体系和PCR情况基本相同，预防的方法也相同，主要就是严格分区，勤于环境去污。先达基因的全能核酸酶（EM109）处理效果显著。
2）引物/探针错配：这方面主要在引物设计初期就要从引物的错配，二级结构等方面避免，在引物筛选中也要重点监控与验证。
6.先达基因核酸释放剂产品设置的内参，除鼻咽拭子，其他体液样本适用吗?
ERA产品配套的释放剂可以实现采样直扩，目前我们在鼻拭子，口腔拭子，以及肛拭子经简单处理后取上清为模板进行扩增都取得很好的检测效果，具体的样本类型可以咨询我们的技术人员，以推荐合适的样本处理方法。
7.假如实验操作没有问题，但结果的重现性依然很差，问题主要出现在恒温扩增的哪方面?
对于ERA的产品，影响一致性的主要因素在于操作的速度和操作的精准性，其次就是设备的温度的稳定性，荧光值读取的一致性。
8.为什么扩增结果信号不稳定?
ERA体系反应速度非常快，存在不确定性，信号的稳定性与操作一致性密切相关。
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