RT-基础型核酸扩增试剂盒（ERA法）使用说明书
先达基因 / 2021-01-05
RT-基础型核酸扩增试剂盒（ERA法）使用说明书
（产品货号：KS102）
试剂盒标配材料
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组分 |
24T |
96T |
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溶解剂 DA （白盖） |
1.2mL |
1.2mL*2 |
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激活剂 MC （绿盖） |
250μl |
250μl |
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阳性引物 PM （蓝盖） |
180μl |
180μl |
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阳性标准品 （红盖） |
80μl |
80μl |
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6* Loading Buffer（紫盖） |
1mL |
1mL |
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RT-基础扩增试剂（铝箔袋） |
24T*1 |
24T*4 |
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使用说明书 |
1份 |
1份 |
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检测下限 |
本试剂盒最低检测下限为10-100copies/测试（依据引物筛选优化程度和检测手段）
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存储条件及有效期 |
存储在-20±5℃、干燥、避光的环境，有效期1年。
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详细实验方案（反应体系为 50μl） |
1. 按照以下所述制备每份样本的预混液：
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组分 |
每管加样量/μl |
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溶解剂[1] |
20 |
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正向引物 (10μM) |
2.5 |
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反向引物 (10μM) |
2.5 |
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模板RNA |
2≤x≤10 |
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ddH2O |
23-x |
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体积 |
48 |
充分振荡混匀并短暂离心。
2. 对于每份样本，将48μl预混液转移至每管RT-基础扩增试剂[2]中。振荡混匀[3]直到扩增试剂重悬，并短暂离心。
3. 对于每份样本，在反应管盖上加上2μl激活剂[4]，小心盖紧管盖，通过短暂离心使激活剂进入预混液中。短暂振荡混匀[5]并再次快速离心。
4. 将反应管放入恒温仪（40-42℃）中孵育20分钟。
5. 孵育结束后[6]，应立即使用产品自带6*Loading Buffer，按所需量（每10μl样品加1.5μl Loading Buffer）添加后，56℃孵育5分钟，然后在琼脂糖凝胶上跑胶，或纯化ERA扩增产物[7]进行其他下游应用。
操作注意要点：
[1] 溶解剂需完全融化混匀，否则会对实验产生影响。
[2] RT-基础扩增试剂在使用前放置室温平衡10min，剩余未用尽的试剂应注意防潮密封保存。
[3] 此处振荡混匀旨在将扩增试剂重悬，使体系分散均匀，混匀时间应在3-5s，3000rpm。
[4] ERA反应是靠激活剂来启动，一旦加入激活剂，务必立即上机孵育。
[5] 此处振荡混匀时间应在3s左右，时间过长会导致检出时间延后。
[6] 孵育结束后必须立即终止反应【纯化或者使用蛋白酶K（5μg/100μl）消化处理】，否则反应会继续进行，产生大量非特异性扩增，影响实验结果。
[7] ERA是一类多酶反应体系（即酶促重组等温扩增技术），若不做纯化直接跑核酸电泳胶，会堵塞胶孔，核酸无法跑出。
阳性对照反应
RT-基础型核酸扩增试剂盒包括阳性引物和阳性标准品（浓度：108cp/μl），可用于检测试剂盒各组分的活性。检测方法与上述实验方案相同（阳性引物Primer mix添加量为4μl），反应温度推荐使用40℃。阳性对照反应可生成172个碱基对组成的扩增产物，凝胶电泳时将出现相应条带。
注意事项
1. 本试剂盒仅用于非医用检测；应存储于-20±5℃、干燥、避光的环境。
2. ERA扩增产物的气溶胶易造成假阳性，为避免交叉污染，试剂配制区与扩增分析区应分隔开。
3. 实验时应设置不加模板的空白对照，以确认是否有待扩增核酸的污染。
4. 在不同的核酸提取方法下，所提取的样本RNA含量和纯度会有差异，可能会导致出现扩增效率不一的现象（详情请查阅PCR抑制剂：乙醇、苯酚、血红素等等）。
5. 阳性标准品建议添加2μl，待检样本添加量范围为2μl~10μl。如果待检样本浓度较高，则仅需添加2μl，反之，则加大样本添加量，最大体积不超过10μl。
7. 如果模板RNA拷贝数低，请在反应5分钟后取出反应管，振荡混匀并短暂离心，再放回恒温仪中。
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