急性肝胰腺坏死病病原（AHPND/EMS）核酸检测试剂盒
先达基因 / 2021-10-14
使用说明书
（产品货号：KW109）
试剂盒标配材料
|
组分 |
24T |
96T |
|
溶解剂 DA （白盖） |
1.2mL |
1.2mL*2 |
|
激活剂 MC （绿盖） |
250μl |
250μl |
|
阳性质控 （红盖） |
80μl |
80μl |
|
荧光检测试剂 （铝箔袋） |
24T*1 |
24T*4 |
|
使用说明书 |
1份 |
1份 |
|
检测下限 |
本试剂盒最低检测下限为100-1000copies/测试
|
存储条件及有效期 |
存储在-20±5℃、干燥、避光的环境，有效期1年。
|
详细实验方案（反应体系为 50μl） |
1.按照以下所述制备每份样本的预混液：
|
组分 |
每管加样量/μl |
|
溶解剂[1] |
20 |
|
模板DNA |
2≤x≤10 |
|
ddH2O |
28-x |
|
体积 |
48 |
充分振荡混匀并短暂离心。
2. 对于每份样本，将48μl预混液转移至每管荧光检测试剂[2]中。振荡混匀[3]直到扩增试剂重悬，并短暂离心。
3. 对于每份样本，在反应管盖上加上2μl激活剂[4]，小心盖紧管盖，通过短暂离心使激活剂进入预混液中。短暂振荡混匀[5]并再次快速离心。
4. 将反应管放入恒温仪（40℃）中，启动检测，持续20分钟，每30秒采集一次FAM通道荧光值。
5. 反应结束后，保存数据并弃置样本管。
操作注意要点：
[1] 溶解剂需完全融化混匀，否则会对实验产生影响。
[2] 荧光扩增试剂在使用前放置室温平衡10min，剩余未用尽的试剂应注意防潮密封保存。
[3] 此处振荡混匀旨在将扩增试剂重悬，使体系分散均匀，混匀时间应在3-5s，3000rpm。
[4] ERA反应是靠激活剂来启动，一旦加入激活剂，务必立即上机孵育。
[5] 此处振荡混匀时间应在3s左右，时间过长会导致检出时间延后。
阳性对照反应
本核酸检测试剂盒包括阳性质控（浓度：105cp/μl），可用于检测试剂盒各组分的活性。检测方法与上述实验方案相同，反应温度推荐使用40℃。本荧光检测试剂中含探针，并带有荧光素（FAM）标记物，最佳激发波长为492nm，最大发射波长为520nm。
注：如使用ABI系列PCR仪，请务必于passive reference和quencher处均选择“none”。
结果判定
检测结果曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线，可报告样品阴性，不含有检测项目核酸成分或含量低于检测限；检测结果曲线呈“S”型扩增曲线，可直接报告样品阳性，含有检测项目核酸成分；NG反应为平滑直线，PG 反应为“S”型扩增曲线，此次检测结果有效，否则无效。
注意事项
1. 本试剂盒仅用于非医用检测；应存储于-20±5℃、干燥、避光的环境。
2. 推荐使用先达基因核酸释放剂（目录号：NR201)：取芝麻大小动物组织（约15mg），加入到150μl核酸释放剂中，振荡混匀，95℃水浴2min后轻微振荡混匀，快速离心以备下用。或采用DNA抽提试剂盒等方式提取核酸。
3. ERA扩增产物的气溶胶易造成假阳性，为避免交叉污染，试剂配制区与扩增分析区应分隔开。
4. 实验时应设置不加模板的空白对照，以确认是否有待扩增核酸的污染。
5. 在不同的核酸提取方法下，所提取的样本DNA含量和纯度会有差异，可能会导致出现扩增效率不一的现象（详情请查阅PCR抑制剂：乙醇、苯酚、血红素等等）。
6. 阳性质控建议添加2μl，待检样本添加量范围为2μl~10μl。如果待检样本浓度较高，则仅需添加2μl，反之，则加大样本添加量，最大体积不超过10μl。
7. 如果模板DNA拷贝数低，请在反应4分钟后取出反应管，振荡混匀并短暂离心，再放回恒温仪中。
8. 任何能激发和检测所选荧光团，并能将温度稳定于40℃的荧光检测仪都适用于荧光探针检测（GS8荧光恒温扩增仪，ABI 7500，LightCycler480，CFX 96等荧光定量PCR仪）。
9. 扫码关注公众号，输入“问题解答”获取操作视频及常见问题解决方案。
