猪流行性腹泻病毒（PEDV）是一种肠道冠状病毒，可引起未断奶仔猪急性水样腹泻和呕吐，死亡率高，给养猪业造成严重的经济损失。

目前，虽然减毒疫苗在中国商业猪场中普遍使用，但它们并不能完全预防所有突变的野生型毒株。现有的核酸检测方法具有较高的灵敏度和特异性，但检测过程十分复杂且需要昂贵的仪器等限制条件给疾病的检测带来了阻碍。

而在近日，安徽省农业大学动物科技学院研究者发布文章，将逆转录-酶重恒温扩增(RT-ERA)与CRISPR-Cas12a系统相结合，开发了一种快速诊断方法来区分PEDV野生型疫苗株和减毒疫苗株并取得突破性成果，通过由先达基因研发的酶促恒温扩增技术（ERA 技术），实现了对PEDV的现场准确快速核酸检测。

研究内容

该方案使用 crRNA 和 RT-ERA 扩增引物探针，在37°C 下对预定义的目标序列进行 Cas12a/crRNA 复合物检测 30 分钟，从而在 LED 蓝光下产生肉眼可见的结果。

该检测具有高度灵敏性和特异性，每次检测仅检测两个目标基因拷贝，并且与其他猪病原体无交叉反应性。总体而言，这种集成的 RT-ERA 预扩增和 Cas12a/crRNA 裂解测定是可靠和快速检测 PEDV 以进行诊断鉴别的实用工具。

RT-ERA由苏州先达基因科技有限公司开发，能够将模板RNA逆向为cDNA。研究者报告了 RT-ERA 与 CRISPR/Cas12a 的首次组合，以开发一种视觉检测，可以立即检测和区分 PEDV 减毒疫苗株与野生型病毒株。最佳条件包括在 37°C 下进行 20分钟的 RT-ERA 反应和在 37°C 下进行 5 分钟的 Cas12a/crRNA 裂解测定。

开发的检测方法具有耗时少、特异性强等优点，检测结果与RT-PCR媲美 ，并且适用于临床应用，可以通过早期控制传染病的传播来减少牲畜损失。

Cas12a/crRNA检测概要：

(A) PEDV全基因组中不同基因位置的示意图；

(B) RT-ERA的扩增原理的流程图；

(C) Cas12a/crRNAPEDV检测的工作图示意图 。

作者以此建立了一种基于Cas12a/crRNA的可视化、 简单、可靠的核酸检测方法，在临床和资源有限的环境下鉴定PEDV经典减毒疫苗株和野生型毒株。该方法具有特异性强、灵敏度高等优点。这是使用RT-ERA和Cas12a/crRNA方法检测PEDV的首次报告。该方法的概念也可用于SARS-CoV-2检测方法的开发。

原文链接：https://doi.org/10.1007/s00216-021-03716-7