背景介绍：非洲猪瘟病毒（ASFV）和山羊痘病毒（CaPV）给畜牧业造成了巨大的经济损失。目前，市场上迫切需要开发一种可靠的检测方法，能快速检测到这两类病毒。此次实验，开发了一种结合ERA技术和CRISPR/Cas12a的ASFV和CaPV的快速快速检测方法，命名为 one-pot-RPA-Cas12a (OpRCas)平台。

OpRCas作用原理

OpRCas平台基于ERA和CRISPR/ Cas12a，如下图1所示 ，目标基因通过试管底部的ERA扩增数十亿次（图1A ），Cas12a通过与crRNA配对来识别并结合扩增子，激活其顺式裂解和反式裂解活性（图1B）。

OpRCas检测ASFV和CaPV平台的特异性：

OpRCas平台检测ASFV（A、C、E）和CaPV（B、D、F）的特异性。在ASFV试验中，样本从左至右分别为LSDV、SPPV、ASFV、GTPV、CSFV、猪肉、BTV、阴性对照组；在CaPV试验中，样本从左至右分别为SPPV、GTPV、LSDV (v)、LSDV (w)、VV、SPV、BTV、PPRV、阴性对照组；A、B为实时荧光强度，C、D为对应的荧光图像，E、F对应的LFA条带。

OpRCas平台的灵敏度测试：

OpRCas平台用于检测ASFV（A、C、E、G）和CaPV（B、D、F、H）的灵敏度。ASFV浓度为12ng/µL~1.2×10⁻⁶ng/µL，CaPV浓度为7.7ng/µL~7.7×10⁻⁶ng/µL。在每组测试结束时都设置了一个阴性对照。A、B、荧光强度；C、D对应的荧光图像；E、F对应的LFA条带。荧光强度与浓度之间的线性关系，FASFV= −437.55×(-lgC)+2832.1 (R²=0.9828)、FCaPV= −555×(-lgC)+2719.33 (R²=0.9879)。

OpRCas平台在临床诊断中的应用：

利用OpRCas平台对14个ASFV样品（A1~A14）和16个CaPV样品（C1~C16）进行了分析。如图4A、E所示，7份样本均为阳性，A7、A8、A9、A10、A11、A12、A13，其余均为阴性。此外，图4C显示了LFA条带的结果。显然，从A7到A13的样品在T线上有明显的条带，而其他样品只在C线上有条带。这些结果与荧光信号相同。为探究检测的准确性，对ASFV样品采用标准方法qPCR进行检测，发现qPCR的结果与图4G中的荧光信号一致。以上数据表明，OpRCas平台检测ASFV的准确率为100%。如图4B、F所示，利用平台检测CaPV样品，发现C1、C2、C3、C7、C8、C9、C10、C11、C13、C15样品荧光较强，C4荧光强度为弱阳性，其他均为阴性。如图4D所示，在LFA条带检测中，大部分结果与阳性样品在T线上有明显的条带，而阴性样品只在C线上有条带，这与荧光检测结果相同。

然而，C4样本显示了不同的结果，即阴性结果。这是因为它的浓度低于该条带的检测极限。在qPCR的验证过程中，C4和C10的结果均为阴性，说明qPCR的敏感性可能不足以准确检测到它们。总体而言，OpRCas平台在检测CaPV相比qPCR检测具有更好的灵敏度。

综上所述，OpRCas是一种临床上稳定可靠的恒温DNA病毒检测技术，在临床应用中比qPCR更方便、更灵敏。

单锅ERA-Cas12a（OpRCas）平台具备ERA技术和CRISPR/Cas12a的优点，如放大率高、恒温反应和严格的目标选择性，使诊断简化、准确、易于操作，无需昂贵的设备。同时，在实验中可一次性将ERA和CRISPR/Cas12a的混合试剂加入到管盖和管底，克服了两种反应的不兼容性和气溶胶污染。为了节省成本，此次实验将常规ERA试剂，控制在每个反应四分之一剂量中，并足以实现临床诊断。