关于细胞培养中的污染

今天给大家整理了下关于细胞污染的相关知识，希望能对大家细胞培养有所帮助。

细胞污染主要常见类型

细菌污染

细胞被细菌污染后培养液会变浑浊，溶液PH值急速变化，对细胞生长影响明显，污染严重的还会导致细胞死亡。

真菌污染

真菌污染的细胞培养液中会出现白色、浅黄色及黑色的小点。由于真菌生长的比较慢，等到发现有真菌感染的症状时候，其实细胞已经污染

很严重了，很难救治。

支原体污染

细胞被支原体污染后细胞不会立即死亡，细胞培养液不会发生浑浊，并且污染初期阶段在高倍显微镜下观察其细胞形态也不会发生明显改变，需要花很多的精力去识别。因此细胞支原体污染难以察觉，具有极大的隐蔽性，对细胞的潜在的威胁更大。

细胞支原体污染（电镜观察）

支原体介绍

1）支原体作为目前发现的生物界最小无细胞壁的原核细胞，大小介于细菌和病毒之间，直径约为0.2-0.3um，可以通过常用的除菌滤膜（0.22-0.45um），导致细胞培养中很难避免支原体的污染。

2）支原体细胞膜分为三层，内外层为蛋白质，中间为脂质，含有胆固醇较多，使支原体膜更具柔顺性，这个特性使得支原体对脱水、渗透压、压力等物理因素抵抗力大大增强，支原体没有细胞壁，对普通的抗生素有抗性，所以细胞一旦被支原体污染就很难清除干净。

3）现在已经被发现的支原体大约有200多种，其中细胞培养过程中导致污染的最常见支原体类型主要包括：猪鼻支原体（M. hyorhinis）、发酵支原体（M. fementans）、精氨酸支原体（M. arginina）、口腔支原体（M. orale）、人型支原体（M. hominis）、唾液支原体（M.salivarium）、梨支原体（M. pirum）和莱氏无胆甾原体（A. laidlawii）。根据报道，95%的细胞污染是由这8种支原体造成的。

支原体污染对细胞的影响

1）支原体会和宿主细胞竞争培养基营养成分，大量消耗细胞培养基中的必需氨基酸（如谷氨酸等），影响细胞生长和形态结构，从而对细胞代谢、基因表达产生巨大影响。

2）被支原体污染后细胞生长速度变慢，细胞发生病变，表现为细胞体积增大，碎片增多，在细胞质中产生颗粒。培养瓶中细胞与细胞间隙出现膜状沉积，细胞无法传代，甚至整个细胞群体溶解。支原体还会导致细胞染色体断裂、数目减少。支原体可通过影响巨噬细胞的活性，抑制干扰素的合成或降低其活性，从而加大了细胞感染病菌和病毒的几率。

3）细胞被支原体污染后，所得到的实验数据和结论不具有可信度。支原体污染导致实验室一些珍贵的细胞损失。

4）由支原体污染细胞进行生物制剂生产时，更会导致终产品不合格，给工业生产带来巨大经济损失，生产的疫苗会失去了药效价值，人和动物接种这样的疫苗将大大增加患病的风险；人体输入遭受支原体污染的细胞治疗产品会有生命危险。

支原体污染的预防

细胞一旦被支原体污染，就需要采取一定的方法清除，但各种清除方法均比较麻烦，且效果不确定，彻底清除是非常困难的，这是一个公认的棘手问题。如果污染细胞价值不大，应丢弃，重新培养；保持细胞培养不受支原体污染的最容易、最简单的方法就是做好预防措施。

1）一般在培养液中添加抗生素

2）严格细胞室无菌操作管理制度，注意环境消毒

3）新进细胞应采取一定的方法检疫确定没有支原体污染才能使用

4）从规范的专业机构引进细胞，新近细胞应及早留种冻存，一旦发生污染可重新复苏培养

5）坚持定期对培养的细胞或有关的试剂进行支原体检测

有关支原体的检测规定

由于细胞支原体污染的隐蔽性及对细胞的严重影响，细胞的支原体污染已经成为了一个比较棘手的世界性难题。

1）从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测

2）欧洲药典规定对细胞治疗产品需要进行严格的支原体检测

3）美国FDA规定为了提高细胞生物制品安全性，需要进行支原体污染检测

4）中华人民共和国药典规定主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞应进行支原体检测

日常实验应提高对支原体污染的警惕，坚持定期做支原体的检测，努力杜绝污染。所以寻找一种快速简单灵敏的方法进行细胞支原体常

规检测就显得尤为重要。

到目前为止，出现了很多支原体的检测方法，有传统检测方法（包括直接培养法和DNA荧光染色法）、ATP酶法、免疫法（ELISA法等）以及分子诊断方法（包括普通PCR和荧光PCR、重组酶扩增技术等），这些技术在检测时间，检测准确性，灵敏度和特异性上有不同的差别。

培养法简单直观，一般需要培养28天才能判断是否有支原体的污染，工作量大。DNA荧光染色法操作较为简便，检测快速。但是该方法灵敏度比较低，因背景荧光的存在，细胞轻度支原体污染不易检出。

PCR方法由于引物设计特异性较强，可以进行种属的鉴别。比常规培养法检测时间大大缩短，比DNA荧光染色法具有较高的特异性，能够鉴别支原体的不同种。但最令人头痛的问题是PCR扩增产物污染，因为PCR产物拷贝量大，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。

实时荧光定量PCR具有比PCR检测快，灵敏度高的优势，尤其适合样品模板含量较低时使用，实时荧光定量PCR能通过溶解曲线能够判断特异性扩增。实时荧光定量PCR需要配套价格高昂的荧光定量PCR仪器，而且设备维护费用高，机器设置操作复杂，需专业人员，难以得到全面推广。

ATP酶法能够检测的支原体种类比较全，检测结果能够量化，容易判断，耗时短，整个实验过程需要20分钟左右。由于ATP酶法主要依赖支原体酶活性的发挥，任何影响酶活性的发挥都有可能影响结果的准确性，ATP酶法需要使用荧光分光光度计，且商品化的支原体检测试剂盒价格昂贵，大面积推广使用成本较高。通过比较实时荧光定量PCR、和ATP酶法可以看出，基于核酸扩增检测支原体的方法在其灵敏度和准确性上仍是支原体快速筛选检测的首要手段。因此，开发一种操作简便、特异性强、灵敏度高的基于核酸扩增的支原体检测方法是非常有意义的。

先达基因生产的专利产品支原体荧光检测试剂盒，提供了一种快速简单灵敏的细胞支原体检测方法，能检测的支原体种类超过了130种，产品货号KS201，产品详情请咨询：0512-68439557。

试剂盒可检测的支原体种类

检测方法操作流程

不同支原体检测方法比较

产品特点

试剂盒可配合先达基因生产的荧光恒温扩增仪GS8使用，实现恒温扩增与荧光信号检测于一体。