酶，作为核酸扩增检测试剂的主要原材料之一，其关键作用不言而喻，其在分子诊断产品成本中更是具有举足轻重的影响。而在“国产替代”、“集采”等大环境下，实现核心原料国产化的企业，也将拥有更多的机会与主动权。现在，我们不妨先看看核酸扩增的常用酶有哪些？

一、PCR常用酶

1.尿嘧啶DNA糖基化酶

尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)又称尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)，可水解含尿嘧啶的单链和双链DNA释放出游离尿嘧啶，而对RNA无活性，与dUTP搭配使用，可建立成PCR防污染体系。其原理如下：在PCR体系中将dTTP部分或全部替换为dUTP后，使得反应生成含有dU碱基的扩增产物，这些扩增产物不同于天然模板，在进入含有UDG酶的反应体系时，可被UDG酶识别并切割尿嘧啶碱基与糖磷酸骨架间的N-糖基键，而经切割后的DNA链在碱性或高温条件下易于断裂降解，从而失去被当作模板再扩增的能力，因此可防止扩增子污染（如下图）。

市面上的UDG酶主要有普通型和热敏型，其中热敏型UDG酶在室温条件下即可催化反应，50℃以上加热可使其灭活，防止其降解后续PCR形成的含dU扩增产物。

虽然UDG/dUTP体系具有防污染功能，但在实际测试中还得兼顾PCR的效率和灵敏度。一方面需确保PCR扩增产物掺入足够量的尿嘧啶碱基，从而可被UDG有效切割；另一方面也需要保证反应体系添加的dUTP不会明显影响PCR效率，因此dTTP和dUTP的最佳比例需通过优化确定。

2.逆转录酶

逆转录酶又称反转录酶，是一种RNA介导的DNA聚合酶，其反应过程中体现出三种功能为：

①以RNA作为模板合成互补DNA链 (complementary DNA, cDNA)，形成RNA:cDNA杂交链；

②发挥RNase H活性，降解RNA:DNA杂交链中的RNA模板；

③以cDNA作为模板合成第二链DNA，形成双链DNA（如下图）。

其中，RNaseH活性是逆转录酶的一个内在特性，可在合成过程中同时切割RNA:cDNA杂合链中的RNA模板，该特性可能降低逆转录效率，因此在实际应用中，常采用人工改造后的低或无RNase H活性的逆转录酶。常用的逆转录酶有AMV和M-MLV，AMV分离自禽类成髓细胞瘤病毒(Avian Myeloblastosis Virus, AMV)，M-MLV逆转录酶分离自莫洛尼氏鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus, MMLV)，前者热稳定性优于后者，但AMV逆转录酶的RNaseH活性也更强，不利于长片段cDNA合成。市面上多使用经基因工程改造过的M-MLV逆转录酶，其热稳定性改进，可在50℃左右工作，同时RNase H活性进一步减弱，提高了其逆转录效率。

3.Taq DNA聚合酶

Taq DNA聚合酶是从水生噬热杆菌(Thermus aquaticus)中提取获得的热稳定DNA聚合酶，可以DNA作为模板合成DNA。因其出色的热稳定性，可结合温度循环变换过程，在体外完成DNA的复制。目前体外诊断试剂常用具有热启动(Hot start)功能的Taq DNA聚合酶，该类酶通过修饰抑制其在低温条件下的活性，防止其在未达到预设温度时出现非特异性扩增，只有在温度升高后，解除抑制，才释放酶活性，从而进入PCR循环扩增过程。常用的TaqDNA聚合酶热启动修饰方法主要有化学修饰、抗体修饰和配体修饰。

化学修饰一般采用化学反应使一些化学小分子（如酸酐等有机物）与聚合酶上的侧链氨基酸(赖氨酸)反应封闭酶活性，只有温度升高后，酸酐与氨基之间的化学键断裂，才表现出DNA聚合酶活性。一般情况下，化学修饰的聚合酶高温启动时间相对较长。

抗体修饰是在Taq DNA聚合酶中添加抗体封闭其活性，使其在低温下无法启动扩增，直至反应体系温度升高使得抗体变性脱落后，DNA聚合酶才被释放活性并启动扩增。抗体修饰的酶活性释放速度快，但抗体与Taq DNA聚合酶的配比需通过优化确定，以便两者达到动态平衡过程。

配体修饰主要借助核酸适配体封闭酶活性，该类适配体多为一段具有特异性识别功能的寡核苷酸分子，可形成特定的空间构象，通过非共价键与Taq DNA聚合酶结合，进而抑制其在非许可温度下的聚合反应。配体修饰的聚合酶活性是可逆的，且热激活温度相对较低。如下图所示的配体修饰酶，在温度达到60℃时则释放DNA聚合酶活性；当温度降低至55℃以下时，则酶活性又可被重新封闭（如下图）。

4.Pfu DNA 聚合酶

Pfu DNA聚合酶来源于嗜热古细菌(Pyrococcus furiosis)，是一种高保真耐高温DNA聚合酶，它不具有5'→3'外切酶活性，但具有3'→5'外切酶活性，可校正PCR扩增过程中产生的错误，使产物碱基错配率降低，且其PCR产物为平末端。主要用于保真度要求比较高的PCR反应，如克隆PCR、基因定点突变和全基因合成等。

二、恒温扩增常用酶

恒温扩增的方法多种多样，其对应的酶体系也各有差别，且一般为多酶体系，在酶原料选择上相比PCR复杂，下面只列举一些主要的恒温扩增方法相关酶。

1.LAMP相关酶

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)所用酶主要为具有链置换功能的DNA聚合酶，

常用酶为Bst DNA聚合酶，用于DNA链合成，同时具有链置换功能；若检测模板为RNA，则可加入逆转录酶配制成RT-LAMP反应体系。

2.TMA相关酶

依赖转录介导扩增(Transcription mediated amplification, TMA)的扩增模板为RNA或单链DNA，检测的扩增产物为RNA。

该体系所用酶有两种：

①M-MLV逆转录酶：用于模板RNA逆转录成DNA，并在逆转录过程中通过引物引入转录启动子序列，用于后续转录过程；

②T7 RNA聚合酶：以逆转录形成的DNA为模板，转录合成检测产物RNA。

3.ERA相关酶

ERA技术（Enzymatic Recombinase Amplification，酶促恒温扩增技术）是一种多酶协作的反应体系。

该体系反应酶包含三种：

①重组酶：可与引物结合形成复合体，定位至与引物同源的靶序列，促使引物与模板结合，同时帮助DNA解链，以便启动扩增；

②单链DNA结合蛋白：可与被置换出的DNA单链结合，稳定单链结构；

③DNA聚合酶：如Bsu DNA聚合酶，用于DNA链合成，同时具有链置换功能。

对于RNA模板，需在反应中加入逆转录酶形成RT-ERA体系；若利用标记探针进行检测，还需加入核酸酶对探针序列进行切割，常用核酸酶有核酸内切酶 IV(Endonuclease IV, nfo)和核酸外切酶 III(Exonuclease III, exo)，或者可与CRISPS/Cas系统搭配使用。

4.HDA相关酶

解旋酶依赖性扩增技术(Helicase-Dependent Amplification, HDA)也是一种多酶协作的反应体系。

反应体系的三个主要酶是：

①解旋酶：如UvrD解旋酶，用于解开DNA双螺旋结构，以便形成单链；

②单链DNA结合蛋白：可与解链后的DNA单链结合，稳定单链结构；

③DNA聚合酶：催化合成DNA链，常用Bst聚合酶或Klenow聚合酶等。

三、双功能酶

1.Tth DNA聚合酶

Tth DNA聚合酶是分离至嗜热细菌(Thermus thermophilus)的热稳定性酶，兼具逆转录和DNA聚合酶活性。在Mn2+条件下，主要表现为逆转录酶活性，即以RNA为模板合成DNA；而在Mg2+条件下，则具有较强的DNA聚合酶活性，以DNA为模板合成DNA。由于该酶可耐受较高温度，因此逆转录步骤可在较高温度下进行，但该酶表现出的活性依赖于不同的二价阳离子，在RT-PCR体系中较难兼容，其逆转录酶活性往往达不到预期，因此在实际使用中，有时还需添加逆转录酶确保逆转录效率。

2.RevTaq RT-PCR DNA聚合酶

RevTaq RT-PCR DNA聚合酶是经人工定向改造后的耐高温双功能酶，同时具有逆转录酶和DNA聚合酶活性。该酶不同于Tth DNA聚合酶，其逆转录酶活性无需Mn2+参与，在PCR循环扩增过程中即可同步进行逆转录步骤，实现 “zero-step” RT-PCR。因此其逆转录过程可在较高温度下进行，引物需相应设计为较高的Tm值。

3.Bst 3.0 DNA聚合酶

Bst 3.0 DNA聚合酶是在Bst DNA Polymerase I(大片段)基础上改造并融合了新型的核酸结合域，使其等温扩增效率提高，逆转录活性也增强，因此可直接用于单酶体系的RT-LAMP。

四、小结

对于RNA模板，通常需加入逆转录酶参与扩增反应，该酶的活性也直接决定了检测的效率。虽然市面上也有包含逆转录酶活性的双功能酶，但其应用范围依然较小。不过，双功能酶实现RNA的单酶检测，抑或“零步法”RT-PCR，总让人充满期待。

苏州先达基因（gendx.cn）致力于分子诊断POCT化产品与现场快速一体化解决方案的研发及产业化应用的公司，其核心团队有来自全球最大的PCR实验基地与基因合成中心的分子生物学专家、有分子诊断行业酶制剂研发和生产专家，以及生物制药工程专家，对PCR底层技术革新有更深刻的理解。

该团队将先进的抗体制药领域技术应用于核酸扩增技术中核心酶的改造和优化，研发出新一代的酶促恒温扩增技术（ERA技术）。基于此平台开发了多系列的核酸诊断试剂及其配套的便携式检测设备，产品涵盖食品安全快速检测、畜牧水产快速检测、体外分子诊断、POCT诊断试剂盒等领域。同时其酶原料亦有销售。

多酶系统虽然增加了原料成本，在体系优化上也是提高了难度，但也正是多个酶的巧妙组合，才成就了各种各样的恒温扩增方法。

另外，人工定向改造，也为酶功能带来了无限可能，更是在扩增检测方法上，给人带去更多的想象力。