导读

2016年，在美国发生急性死亡并伴有类似猪皮炎和肾病综合征临床症状且表现繁殖障碍的母猪体内分离出一种新型圆环病毒——猪圆环病毒3型（PCV3）。PCV3是一种与种猪皮炎和肾病综合征(PDNS)相关的疾病，自2016年发现以来，在亚洲、欧洲、美洲等多个国家的猪群中广泛流行，且有较高的流行率，已使各个国家的养猪业受到严重危害。自 2015 年后，中国猪群的流行率也呈上升趋势，为PCV3 的阳性率介于10%~60%，个别猪场达到 100%。

对该传染病的早期诊断对于防止病毒在全球的快速传播至关重要。但迄今为止，以qPCR为代表的PCV3的高灵敏度、高特异性检测方法需要复杂的设备、训练有素的专业人员和程序，而且费用昂贵、耗时。这种高门槛排除了现场测试，不适合在发展中国家和偏远地区进行广泛应用。

为了建立一种个更为简便、现场、快速、敏感的检测方法来对抗PCV3的快速传播，本研究在等温核酸扩增ERA超增技术的基础上与CRISPR/Cas12a系统结合，开发出了一种针对PCV3的快速、简单、超灵敏检测方法。

（数据来源：Molly Kroeger，Five years of porcine circovirus 3: What have we learned about the clinical disease, immune pathogenesis, and diagnosis，如有侵权请联系删除。）

研究内容

为了建立一种现场快速简便的检测方法来对抗PCV3的传播，安徽省兽医病理生物学与疾病控制重点实验室、安徽农业大学的JianTu 和KezongQi 研究团队等优化了CRISPR/Cas12a系统，并结合等温核酸扩增ERA超增技术对PCV3进行了诊断。结果表明，ERA-CRISPR/Cas12a反应可在1h内从基因组DNA中检测到至少7个拷贝的PCV3，且与PCV2、PCV4或其他猪相关病毒没有交叉反应，揭示了该技术的良好特异性。这些结果证明了ERA-CRISPR/Cas12a在单分子水平上检测DNA的能力，并为PCV3提供了一种快速、简单、超灵敏的一步法检测，并暗示了其在各种核酸检测应用中的潜力。

研究结论

聚合酶链式反应是最常用的病原体核酸检测技术，被认为是病毒核酸诊断和检测的金标准；然而，该方法需要昂贵的设备和训练有素的人员，以及较长的反应时间(~2 h)，不适合于简单快速的PCV3 POCT分子诊断。

CRISPR/Cas12a和Cas13a代表了现场POC测试的可行选项，其中Cas12a更适合于检测DNA病毒，如PCV3，等温扩增的产物可以直接与Cas12a反应，而不需要逆转录。在这里，结合ERA和CRISPR/Cas12a技术，以crRNA为靶向材料，FAM-N6-BHQ1为荧光报告分子，采用LED蓝光或紫外光作为激发光，实时聚合酶链式反应(Real-Time PCR)对结果进行可视化，建立了基于Cas12a的PCV3核酸诊断方法。该ERA-CRISPR/Cas12a 系统能够检测到少至7个拷贝的PCV3，该方法可在水浴或金属浴中进行30min，并可用肉眼观察试验结果。

安徽省兽医病理生物学与疾病控制重点实验室、安徽农业大学的JianTu 和KezongQi 研究团队等自2019年9月至2021年1月从安徽省不同地区采集的30头病猪的淋巴组织样本对该方法进行了验证，并将其与实时荧光定量PCR的检出率进行了比较。两种方法检测PCV3的阳性率均为33.3%(10/30)，证明ERA-CRISPR/Cas12a检测方法相对于现行金标准的准确性和可靠性。

综上所述，安徽省兽医病理生物学与疾病控制重点实验室、安徽农业大学的JianTu 和KezongQi 研究团队等建立的一种ERA-CRISPR/Cas12a方法，用于PCV3的快速检测。该方法具有便捷、操作简单、成本低的特点，为移动检测点的建立提供了极大的优势。

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原文：《Enzymatic Recombinase Amplification Coupled with CRISPR-Cas12a for Ultrasensitive, Rapid, and  Specific Porcine circovirus 3 Detection（IF：3.285）》

作者：Wuyin Zhang, Liang Xu, Qi Liu, Yingli Cao, Kankan Yang, Xiangjun Song, Ying Shao,Jian Tu, Kezong Qi

期刊：Molecular and cellular probes