1、背景介绍

人类、动物和植物的生命不断受到细菌和病毒的威胁。例如，引起结核病（TB）的结核分枝杆菌，它具有高毒性和传染性，对人类生命安全造成巨大的威胁。虽然一些药物具有良好的疗效，但经验性治疗和未经诊断的药物的广泛使用导致耐药。因此，彻底根除结核病还是一个巨大的挑战。WHO组织制定了到2035年结束结核病流行，到2050年根除结核病的目标。因此，区分耐药菌株和野生型菌株尤为重要。

CRISPR/ Cas12目前在生物检测领域中发挥重要作用。CRISPR RNA（crRNA）在特异性识别DNA后，Cas12a的顺式切割和反式切割活性被激活以分别切割靶标和任何周围的单链DNA（ssDNA）。基于这一特性，CRISPR/Cas12a被广泛应用于检测方法和生物传感器中。Cas12a除了crRNA之外还需要“TTTN”的原型间隔区邻近基序（PAM）来识别双链DNA（dsDNA），这限制了其在dsDNA检测中的应用。基于此，作者开发了一种与CRISPR/Cas12a偶联的不对称RPA（Asy-RPA）方法，Asy-RPA可以以dsDNA为模板产生大量的ssDNA，利用Cas12a识别ssDNA的能力检测dsDNA病毒LSDV，从技术上解决了PAM的限制问题。此外，CRISPR/Cas12a可以区分ssDNA上的错配，从而鉴定WT-TB和MT-TB。这种敏感和特异的方法为结核病的根除和治疗提供了一种实用的技术，也为其他没有PAM的核酸提供了新的思路。

2、实验原理

实验人员首先设计了一种Asy-RPA扩增方法，采用较大的引物浓度差异，反应初期以指数扩增产生dsDNA模板，中后期以线性扩增方式产生大量的ssDNA，作为Cas12a的切割靶标。结合CRISPR/Cas12a平台，即可检测任何有或没有PAM的核酸。作者设计了crRNA1，与没有“TTTN”的保守序列配对，用于识别TB，再利用Cas12a的碱基错配不耐受性，设计crRNA2靶向识别rpoB基因上两个密码子区域的c526和c531，从而区分MT和WT-TB。当两个系统都有荧光信号时，将其鉴定为WT-TB。当crRNA1有信号而crRNA2无信号时，鉴定为MT-TB，不能用利福平治疗。当两个系统都没有信号时，说明结核杆菌是阴性的。

原理图: Asy-RPA结合CRISPR/Cas12a区分WT和MT-TB的原理:(A)无论PAM存在与否，Asy-RPA扩增的dsDNA都能激活CRISPR/Cas12a；(B)没有PAM，Cas12a可以区分WT和MT-TB；(C)没有PAM，无论是WT还是MT-TB，Sym-RPA扩增的dsDNA都无法激活CRISPR/Cas12a

3、实验分析

通过Asy-RPA与两种CRISPR/Cas12a系统检测不同浓度的WT-TB。在crRNA1和crRNA2系统中，荧光强度随着浓度从1fM增加到1pM而增加，实际检测限均低至1fM。crRNA2系统效率明显较低，通过分析crRNA的GC含量和结构，发现crRNA的结构对其效率具有显著影响。为了比较Asy-RPA和Asy-PCR的效率，作者通过Asy-PCR扩增不同浓度的WT-TB。随着浓度从500fM降低至100aM，荧光强度连续降低，实际检测限低至100aM，而在crRNA2系统中实际检测限为1fM。再次证明crRNA2的效率低于crRNA1，但Asy-RPA在温度、成本和时间方面具有优势。

图注：在crRNA1 (A)和crRNA2 (B)系统中，不同浓度的CRISPR/Cas12a的Asy-RPA的荧光；在crRNA1 (C)和crRNA2 (D)系统中，不同浓度的CRISPR/Cas12a的Asy-PCR的荧光光谱；以及（E，F）crRNA1和crRNA2的构建。

基于该方法对多种细菌（如WT-TB、MT-TB、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、溶血性链球菌和白色念珠菌）进行检测，只有WT-TB和MT-TB在crRNA1系统中显示出显著的荧光，而其他病毒则没有，验证了该方法的特异性。crRNA2系统中仅WT-TB显著发荧光，而其他病毒没有，这表明crRNA2系统特异性识别WT-TB。使用crRNA1和crRNA2系统的Asy-PCR也显示出相同的结果，这表明引物和crRNA对于TB的检测和突变的鉴定是特异性的。此外，将不同比例的WT和MT-TB混合用于crRNA2系统，随着MT-TB从1%增加到100%，荧光连续降低。Asy-RPA的实际检测限为1%。Asy-PCR也显示出相同的趋势，实际检测限为1%。总之，与crRNA2结合Asy-RPA对WT-TB具有高特异性。

使用CRISPR/Cas12a对Asy-RPA和Asy-PCR进行特异性分析。crRNA1(A)和crRNA2(B)系统中不同细菌的Asy-RPA荧光，以及crRNA2中WT和MT-TB不同比例的Asy-RPA(C)和Asy-PCR(D)结果。

为了评价平台检测结核病的实际效果，作者用含有rpoB基因的质粒转化大肠杆菌，以不同浓度从细菌中提取核酸，模拟结核分枝杆菌。结果显示，CRISPR切割产生的荧光强度随着细菌数量的减少而连续降低。在crRNA1和crRNA2系统中，携带显著荧光信号的最低浓度为4.1×10¹ cfu/mL。此外，Asy-PCR的实际检测限为4.1×10⁰ cfu/mL。

4、总结

CRISPR/Cas 12 a的广泛应用受到PAM的限制。实验证明Cas 12 a可以识别多种PAM序列。尽管如此，它仍然不能覆盖所有的核酸。本文开发了Asy-RPA来摆脱PAM的限制，该平台可以在恒温下灵敏、快速地检测LSDV。此外，基于Cas12a对ssDNA上突变的不耐受性，该方法可检测MT和WT-TB。这为加快治疗和消除结核病提供了技术支持。简单的操作和易于阅读的输出大大方便了工作人员。

5、相关产品

本次实验，实验人员创造的Asy-RPA技术，借助了先达基因研发的ERA 超增技术（酶促恒温扩增技术）中基础型核酸扩增试剂盒（ERA法），为拓宽了CRISPR/Cas12a的应用范围，为任意序列的核酸检测提供了新的技术。(点击产品名称或货号即可查看详细信息）。

基础型核酸扩增试剂盒（ERA法）

货号：KS101

基础型核酸扩增试剂盒，可应用于核酸DNA的快速扩增，检测的灵敏度高，能够将痕量的核酸模板扩增到可以检出的水平。在恒定温度（37℃）下可对特异基因进行扩增及定性检测，可用琼脂糖凝胶电泳等终点法进行结果检测。

文章名称：《Completely Free from PAM Limitations: Asymmetric RPA with

CRISPR/Cas12a for Nucleic Acid Assays》

原文链接：https://pubs.acs.org/action/showCitFormats?doi=10.1021/acssensors.3c01686&ref=pdf

一作作者：曹改花