随着分子遗传学和测序技术的快速发展，基因检测在精确癌症医学中变得越来越重要，许多基因突变现在已被纳入临床指南，以帮助临床医生诊断疾病，选择治疗方法和监测癌症复发。

背景介绍

本篇论文，将CRISPR/Cas12a与ERA超增技术（酶促恒温扩增技术）结合，开发了一种一锅ERA-Cas12a检测方法，称为CoHIT（基于Cas12a的一次性高速等温试验），用于快速、敏感地检测多种同一位点的插入或缺失（indels）。该系统利用了工程化的AsCas12a蛋白变体enAsU-R，能够在30分钟内检测到急性髓性白血病（AML）患者NPM1基因的c.863_8644-bp插入突变，且具有低检测限（0.01%）和无野生型交叉反应性。CoHIT系统还能检测KIT、BRAF和EGFR基因的indels，通过与侧流试纸条和微流控芯片的结合，展示了其在临床癌症诊断中的适应性和多重检测能力。

结果展示

CoHIT系统的工作效率：

从细胞样本中提取患者的基因组DNA，使用一锅ERA-Cas12a检测检测。除了WT序列外，目标DNA位点还可以包含具有几种可能的变异的indels。该反应混物包含ERA试剂、一对引物、FAM-ssDNA-BHQ1报告基因、工程的AsCas12a蛋白enAsU-R和一个crRNA。等温过程中在39°C的扩增反应中，WT和变体1 ~ 3均被快速扩增。同时，Cas12a/crRNA复合物通过序列互补捕获变异1扩增子，以及由于工程AsCas12a蛋白的错配耐受性而捕获的变异2和变异3扩增子，然后发出绿色荧光信号。然而，由于WT的扩增子与crRNA的识别序列有较大的差异而被忽略，且没有观察到交叉信号。仅使用便携式等温荧光探测器，就可在30 min内完成检测。

NPM1基因突变的检测能力：

在108名AML患者的样本中，CoHIT系统成功识别出30名患者的NPM1基因突变，这些突变主要是c.863_864位点的4-bp插入。该系统的检测结果与下一代测序（NGS）的结果完全一致，而第一代的测序（FGS）则漏检了四个低突变率的阳性样本。

微小残留病（MRD）监测：

CoHIT系统被用于监测三名NPM1突变AML患者的MRD，结果显示该系统能够准确检测到MRD水平的变化，为临床提供早期复发预警。在一名患者的随访过程中，CoHIT系统检测到的MRD变化趋势与NGS结果相符，证实了其在MRD监测中的应用潜力。

CoHIT系统的工作效率：

与FGS和NGS相比，CoHIT系统显示出更高的敏感性（100% vs. 86.6%），并且在检测多种插入类型方面表现出优势。

综上所述，CoHIT系统作为一种新型的CRISPR-based检测方法，为癌症相关indels的检测提供了快速、敏感且低成本的解决方案。

最后，感谢武汉大学中南医院科研团队在此次研究中，全程采用先达基因ERA超增技术（酶促恒温扩增技术），同时希望本次研究有望在临床癌症诊断中发挥重要作用！

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